 | | | |
| 應(yīng) 用 | 原 理 | 可使用次數(shù) | catalog # |
| 通用樣品處理 | |||
| readyprep 2-d 凈化試劑盒 | 通過三沉淀去處鹽分、去垢劑、酯類、酚類等化合物 | 50 | 163-2130 |
| readyprep 還原/烷化試劑盒 | 還原/烷化試劑盒 將二硫鍵還原，然后烷基化，從而去除二硫鍵，并防止其重新形成 | 100 | 163-2090 |
| readyprep 總蛋白抽提試劑盒 | 通過強(qiáng)去垢劑 asb-14 溶解細(xì)胞全蛋白 | 20 | 163-2086 |
| 分級(jí)分離 | |||
| 差異溶解 | |||
| readyprep順序抽提試劑盒 | 用sb 3–10分步溶解 | 15 | 163-2100 |
| readyprep 蛋白抽提試劑盒（可溶/不溶） | 用烈性去垢劑 asb-14增溶 | 20 | 163-2085 |
| cellular location | |||
| readyprep 蛋白抽提試劑盒（胞漿/胞核） | 強(qiáng)烈的離液劑抽提后，將細(xì)胞器分離 | 50 | 163-2089 |
| readyprep蛋白抽提試劑盒（膜i） | 用triton x-114增溶 | 50 | 163-2088 |
| readyprep蛋白抽提試劑盒（膜ii） | 碳酸鈉抽提和超速離心; 適合于更復(fù)雜的或不宜用膜i試劑盒抽提的膜蛋白 | 10 | 163-2084 |
| readyprep蛋白抽提試劑盒（信號(hào)） | 用triton x-100增溶 | 50 | 163-2087 |
簡(jiǎn)介
更好的 2-d 分辨率和重復(fù)性
提高分辨率和確保重復(fù)性是2-d實(shí)驗(yàn)zui重要的兩個(gè)目標(biāo)。蛋白樣品制備在實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)目標(biāo)的過程中起到了核心作用。readyprep 試劑盒通過試劑增溶或差異溶解來減少脫尾或降低樣品復(fù)雜性，從而成為用戶可靠的實(shí)驗(yàn)工具。任何一種試劑盒都受到了嚴(yán)格的質(zhì)量控制，從而確保了質(zhì)量的穩(wěn)定和結(jié)果的可重復(fù)性。
使用readyprep 還原/烷化試劑盒，小鼠肝臟樣品的分離效果明顯提高。 兩種樣品均使用杯上樣，11 cm readystrip ph 7–10 ipg 膠條. 左圖, 用含 50 mm dtt水化/上樣緩沖液溶解; 右圖, 用readyprep 還原/烷化試劑盒處理后。
將樣品中過高的鹽分用readyprep 雙向電泳凈化試劑盒去除 含1 m nacl的e. coli樣品中的鹽分去除前（左）和去除后（右）。
使用readyprep 雙向電泳凈化試劑盒可有效去除去垢劑從而提高雙向電泳的分離效果。 e. coli 抽提液摻入 1% sds.未經(jīng)處理的樣品（左）; 處理過的樣品（右）。
三種抽提膜蛋白的試劑盒
根據(jù)不同的樣品進(jìn)行優(yōu)化是蛋白分析的基本原則。近年來膜蛋白質(zhì)研究變得越來越重要，bio-rad公司提供三種readyprep 蛋白抽提試劑盒使您分離膜蛋白的工作變得更加容易。 readyprep 蛋白抽提試劑盒 （膜 i 和 ii） 可得到不同的分離組分。膜 i 試劑盒可快速有效地分離絕大多數(shù)膜蛋白，而無需超速離心或制備密度梯度溶液。更復(fù)雜的膜蛋白用膜ii試劑盒來抽提。readyprep 蛋白抽提試劑盒 （信號(hào)） 是專門為分離膜內(nèi)與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)或跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白優(yōu)化的。這些蛋白包括gpi-錨訂蛋白， caveolin 及其相關(guān)蛋白， 酰化酪氨酸激酶和g蛋白等。
使用不同的試劑盒得到的不同的雙向圖譜：（a）readyprep 信號(hào), （b）膜 i, （c）膜 ii, 和全蛋白 （d） 試劑盒. 用相應(yīng)的抽提試劑盒抽提小鼠肝細(xì)胞蛋白。純化的蛋白 （~450 µg） 加到 17 （a, b, c）或 24 cm （d）, ph 3–10 非線性 readystrip ipg 膠條中。圖中可見 a, b, 和 c的雙向圖譜各不相同，盡管分離的都是膜蛋白。同時(shí)可以看出各自的膜蛋白組分都有了明顯的富集，因?yàn)閐圖的相應(yīng)蛋白點(diǎn)很難看到。
利用蛋白不同溶解度的分級(jí)分離試劑盒
readyprep 順序抽提試劑盒和readyprep 蛋白抽提試劑盒（可溶/不可溶）都通過差異增溶來減少樣品復(fù)雜度。順序抽提試劑盒可將樣品分離成3個(gè)遞增溶解度組份。這3 個(gè)分離份依次分離，使我們能觀察到其它方法觀察不到的蛋白。通過對(duì)每一分離份逐級(jí)使用更強(qiáng)的去垢劑，可提供遞增的增溶強(qiáng)度。readyprep 順序抽提試劑盒中，含有去垢劑sb 3-10 的試劑3 具有zui大溶解強(qiáng)度。相反地，readyprep 蛋白抽提試劑盒（可溶/不可溶）采用了一步分級(jí)分離過程，并使用了一種比sb 3-10 更強(qiáng)的去垢劑，asb-14。這兩個(gè)試劑盒既可單獨(dú)使用；也可將readyprep蛋白試劑盒中的水化/樣品緩沖液與順序抽提試劑盒配合使用，以產(chǎn)生第四個(gè)分離份，獲得更高的分辨率。
具體用途
readyprep 2-d 凈化試劑盒
readyprep 2-d 凈化試劑盒可去除蛋白樣品中的去垢劑、鹽分、小肽、之類和酚類化合物。這些物質(zhì)會(huì)干擾雙向電泳。本試劑盒含有不受去垢劑、離液劑或其它實(shí)驗(yàn)中常用試劑干擾的沉淀試劑，可充分沉淀樣品蛋白，并保證了蛋白樣品的回收效率和濃度。
readyprep還原/烷化試劑盒
readyprep還原/烷化試劑盒首先將半胱氨酸殘基之間的二硫鍵還原，然后將還原出來的巰基烷化，使得這些基團(tuán)*保持還原狀態(tài)。這樣做有助于防止假蛋白點(diǎn)的出現(xiàn)并能讓ipg膠條中更多的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到第二向的sds-page膠中（candiano et al. 2002） 。本試劑盒對(duì)分析堿性蛋白質(zhì)特別有效。因?yàn)槟z條堿性部位的dtt容易電離，在電場(chǎng)作用下遷移出ipg膠條，從而使膠條中dtt減少，蛋白質(zhì)二硫鍵重新形成（herbert et al. 1998） 。絕大多數(shù)生物含有較多數(shù)量的堿性蛋白，這類蛋白的pi值高于ph 7 （wildgruber et al. 2000）。
readyprep 蛋白抽提試劑盒 （總蛋白）
readyprep 蛋白抽提試劑盒 （總蛋白） 是一種操作簡(jiǎn)單、快捷、重復(fù)性好的試劑盒，用來抽提適合于雙向電泳的細(xì)胞全蛋白。試劑盒中離液性*的抽提溶液含有兼性去垢劑asb-14，從而使該溶液能溶解各種細(xì)胞的全蛋白。
readyprep蛋白抽提試劑盒 （膜i）
本試劑盒是利用triton x-114在一定溫度下可與水相分層的原理將蛋白分離 （bordier 1981, santoni et al. 2000）。經(jīng)過zui后一步的離心步驟，溶液被分級(jí)成上層的水相和下層的高去垢劑相。此外還有一些難溶的沉淀，這些沉淀主要是更加復(fù)雜的膜蛋白。進(jìn)入上下兩相的蛋白再用readyprep 2-d 凈化試劑盒（含在本試劑盒中）凈化，以去除抽提過程中混入的可能干擾ief的物質(zhì)。
readyprep蛋白抽提試劑盒 （膜ii）
膜ii試劑盒做為其它膜蛋白分離試劑盒的補(bǔ)充，是專門為有效分離較為復(fù)雜的膜蛋白而優(yōu)化的。抽提的過程用到了碳酸鈉和超速離心機(jī)。試劑盒中的2-d水化/上樣緩沖液含有強(qiáng)離液性的兼性去垢劑asb-14。
readyprep 蛋白抽提試劑盒（信號(hào)）
絕大多數(shù)細(xì)胞的胞漿膜都有富含神經(jīng)鞘磷脂和膽固醇的微區(qū)域（酯筏）。與這些脂筏相的蛋白往往是參與物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)。這類蛋白包括gpi錨訂蛋白、caveolin、caveolae （caveolin-associated proteins）、?；野彼峒っ?、g蛋白異三聚體，以及一些含跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白 （simons and ikonen 1997, brown and rose 1992, parton and simons 1995, anderson et al. 1992） 。與胞膜當(dāng)中這些富含酯類的微區(qū)域相結(jié)合的蛋白質(zhì)在4°c triton x-100的溶液中難溶。readyprep 蛋白抽提試劑盒（信號(hào)） 利用這一原理將信號(hào)蛋白有選擇性地加以回收。
readyprep蛋白抽提試劑盒（胞漿/核）
readyprep蛋白抽提試劑盒（胞漿/核）使用一種專門配制的緩沖液和差速離心將細(xì)胞核完整地分離出來（dignam et al. 1983, zerivitz and akusjarvi 1989）。本試劑盒包含一種強(qiáng)離液性的緩沖液，可有效溶解膜蛋白，并可直接用于雙向電泳分離。如要對(duì)胞漿組分進(jìn)行分析可以將蛋白樣品先用試劑盒中帶的readyprep 2-d 凈化試劑盒處理。
readyprep 順序抽提試劑盒
readyprep 順序抽提試劑盒是為全蛋白質(zhì)組分析而設(shè)計(jì)的。本試劑盒將初始蛋白樣品根據(jù)溶解性的不同分成三個(gè)組分。當(dāng)?shù)鞍椎膩喖?xì)胞定位不能確定時(shí)，本試劑盒還可以用來搜尋特定的蛋白。 依照溶液溶蛋白能力的增加將蛋白樣品進(jìn)行順序抽提可以溶解更多的蛋白，從而使蛋白質(zhì)組的信息更全面 （molloy et al. 1998）。
readyprep 蛋白抽提試劑盒 （可溶/不可溶）
readyprep 蛋白抽提試劑盒 （可溶/不可溶） 可將細(xì)胞全部蛋白分為兩個(gè)組分——以親水性蛋白為主的可溶性組分和以疏水性蛋白為主的不可溶組分。這種簡(jiǎn)單的分級(jí)方法可有效降低樣品的復(fù)雜性，提高低豐度蛋白的檢測(cè)效率，從而在總體上改善總蛋白質(zhì)組的分離效果。
試劑盒中部分試劑介紹
readyprep 順序抽提試劑盒reagent 3—該預(yù)混的樣品緩沖液含硫脲和去垢劑sb3-10，可提高難溶蛋白質(zhì)的溶解效果。使用前加入tbp或dtt可溶解極難溶的蛋白。更多信息請(qǐng)參考資料＃2495。
readyprep 雙向電泳啟動(dòng)試劑盒水化/樣品緩沖液—該標(biāo)準(zhǔn)配方適合許多蛋白樣品；經(jīng)性能測(cè)試的緩沖液能方便地用于制備樣品。
readyprep 雙向電泳啟動(dòng)試劑盒平衡緩沖液i—緩沖液預(yù)混有dtt，用于dtt/ 碘乙酰胺烷化方法的*個(gè)平衡步驟。
readyprep 雙向電泳啟動(dòng)試劑盒平衡緩沖液ii—在緩沖液中加入碘乙酰胺，用于dtt/ 碘乙酰胺烷化方法的第二個(gè)平衡步驟。加入tbp 和丙烯酰胺也可用于單步tbp/ 丙烯酰胺烷化方法。
e. coli 蛋白樣品—該蛋白樣品經(jīng)性能測(cè)試，與readyprep 雙向電泳啟動(dòng)試劑盒的水化/樣品緩沖液配合使用時(shí)，能提供穩(wěn)定的電泳圖譜。在使用更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)樣品前，可以用這個(gè)樣品作為對(duì)照來驗(yàn)證你的雙向電泳系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)操作。
| | | |
| 產(chǎn)品 | 成份 | 包裝 | catalog # |
| readyprep 雙向電泳水化/上樣緩沖液 | 2 m 硫脲, 1% （w/v） asb-14 detergent, 40 mm tris base, 0.001% 溴酚藍(lán) | 10 ml | 163-2083 |
| readyprep 雙向電泳啟動(dòng)試劑盒水化/樣品緩沖液 | 8 m 尿素, 2% chaps, 50 mm dtt, 0.2% bio-lyte 3/10 兩性電解質(zhì), 0.001% 溴酚藍(lán) | 10 ml | 163-2106 |
| readyprep順序抽提試劑盒reagent 1 | 40 mm tris | 50 ml | 163-2102 |
| readyprep順序抽提試劑盒reagent 2 | 8 m 尿素, 4% chaps, 40 mm tris, 0.2% bio-lyte 3/10 兩性電解質(zhì) | 10 ml | 163-2103 |
| readyprep順序抽提試劑盒reagent 3 | 5 m 尿素, 2 m 硫脲, 2% chaps, 2% sb 3–10, 40 mm tris, 0.2% bio-lyte 3/10 兩性電解質(zhì) | 10 ml | 163-2104 |
| readyprep 雙向電泳啟動(dòng)試劑盒 平衡緩沖液 i | 375 mm tris-hcl, ph 8.8, 6 m 尿素, 2% sds, 2% dtt | 20 ml | 163-2107 |
| readyprep 雙向電泳啟動(dòng)試劑盒 平衡緩沖液ii | 375 mm tris-hcl, ph 8.8, 6 m 尿素, 2% sds | 20 ml | 163-2108 |
參考文獻(xiàn)
anderson rg et al., potocytosis: sequestration and transport of small molecules by caveolae, science 255, 410–411 （1992）
bordier c, phase separation of integral membrane proteins in triton x-114 solution, j biol chem 256, 1604–1607 （1981）
brown da and rose jk, sorting of gpi-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface, cell 68, 533–544 （1992）
candiano g et al., two-dimensional maps in soft immobilized ph gradient gels: a new approach to the proteome of the third millennium, electrophoresis 23, 292–297 （2002）
dignam j et al., accurate transc-ription initiation by rna polymerase ii in a soluble extract from isolated mammalian nuclei, nucleic acids res 11, 1475–1489 （1983）
herbert br et al., improved protein solubility in two-dimensional electrophoresis using tributyl phosphine as reducing agent, electrophoresis 19, 845–851 （1998）
molloy mp et al., extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis, electrophoresis 19, 837–844 （1998）
parton r and simons k, digging into caveolae, science 269, 1398–1399 （1995）
santoni v et al., membrane proteomics: use of additive main effects with multiplicative interaction model to classify plasma membrane proteins according to their solubility and electrophoretic properties, electrophoresis 21, 3329–3344 （2000）
simons k and ikonen e, functional rafts in cell membranes, nature 387, 569–572 （1997）
wildgruber r et al., towards higher resolution: two-dimensional electrophoresis of saccharomyces cerevisiae proteins using overlapping narrow immobilized ph gradients, electrophoresis 21, 2610–2616 （2000）
zerivitz k and akusjarvi g, an improved nuclear extract preparation method, gene anal tech 6, 101–109 （1989）
| 目錄 # | 描述 |
| sample preparation kits | |
| 163-2084 | readyprep protein extraction kit （membrane ii） |
| 163-2085 | readyprep protein extraction kit （soluble/insoluble） |
| 163-2086 | readyprep protein extraction kit （total protein） |
| 163-2087 | readyprep protein extraction kit （signal）, 50 preps |
| 163-2088 | readyprep protein extraction kit （membrane i）, 50 preps |
| 163-2089 | readyprep protein extraction kit （cytoplasmic/nuclear）, 50 preps |
| 163-2090 | readyprep reduction-alkylation kit, 100 preps |
| 163-2100 | readyprep sequential extraction kit, 5–15 preps, includes 1 vial reagent 1, 3 vials reagent 2, 2 vials reagent 3, 1 vial tributylphosphine （tbp）, storage vial for tbp, instructions |
| 163-2130 | readyprep 2-d cleanup kit, 50 preps |
| buffers and reagents | |
| 163-2091 | readyprep proteomics grade water, 500 ml |
| 163-2083 | readyprep 2-d rehydration/sample buffer 1, 10 ml, 7 m urea, 2 m thiourea, 1% asb-14, 40 mm tris |
| 163-2102 | readyprep sequential extraction kit reagent 1, 50 ml, 40 mm tris base |
| 163-2103 | readyprep sequential extraction kit reagent 2, 10 ml, 8 m urea, 4% chaps, 40 mm tris, 0.2% bio-lyte 3/10 ampholyte |
| 163-2104 | readyprep sequential extraction kit reagent 3, 10 ml, 5 m urea, 2 m thiourea, 2% chaps, 2% sb 3-10, 40 mm tris, 0.2% bio-lyte 3/10 ampholyte |
| 163-2106 | readyprep 2-d starter kit rehydration/sample buffer, 10 ml, 8 m urea, 2% chaps, 50 mm dtt, 0.2% bio-lyte 3/10 ampholyte, 0.001% bromophenol blue |
| 163-2107 | readyprep 2-d starter kit equilibration buffer i, with dtt, 10 ml, 375 mm tris-hcl, ph 8.8, 6 m urea, 2% sds, 2% dtt |
| 163-2108 | readyprep 2-d starter kit equilibration buffer ii, without dtt or iodoacetamide, 20 ml, 375 mm tris-hcl, ph 8.8, 6 m urea, 2% sds |
| control sample | |
| 163-2110 | e. coli protein sample, lyophilized, 2.7 mg |
| overlay agarose | |
| 163-2111 | readyprep overlay agarose, 50 ml, 0.5% low melting point agarose in 1x tris/glycine/sds and 0.003% bromophenol blue |
| detergent for ief | |
| 161-0460 | chaps, 1 g |
| reducing and alkylating agents | |
| 161-0611 | dithiothreitol （dtt）, 5 g |
| 163-2101 | tributylphosphine （tbp）, 200 mm, 0.6 ml |
| 163-2109 | iodoacetamide, 30 g |
bordier c, phase separation of integral membrane proteins in triton x-114 solution, j biol chem 256, 1604–1607 （1981）
brown da and rose jk, sorting of gpi-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface, cell 68, 533–544 （1992）
candiano g et al., two-dimensional maps in soft immobilized ph gradient gels: a new approach to the proteome of the third millennium, electrophoresis 23, 292–297 （2002）
dignam j et al., accurate transc-ription initiation by rna polymerase ii in a soluble extract from isolated mammalian nuclei, nucleic acids res 11, 1475–1489 （1983）
herbert br et al., improved protein solubility in two-dimensional electrophoresis using tributyl phosphine as reducing agent, electrophoresis 19, 845–851 （1998）
molloy mp et al., extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis, electrophoresis 19, 837–844 （1998）
parton r and simons k, digging into caveolae, science 269, 1398–1399 （1995）
santoni v et al., membrane proteomics: use of additive main effects with multiplicative interaction model to classify plasma membrane proteins according to their solubility and electrophoretic properties, electrophoresis 21, 3329–3344 （2000）
simons k and ikonen e, functional rafts in cell membranes, nature 387, 569–572 （1997）
wildgruber r et al., towards higher resolution: two-dimensional electrophoresis of saccharomyces cerevisiae proteins using overlapping narrow immobilized ph gradients, electrophoresis 21, 2610–2616 （2000）
zerivitz k and akusjarvi g, an improved nuclear extract preparation method, gene anal tech 6, 101–109 （1989）
蛋白混和物可以用化學(xué)試劑，通過分步溶解的方法加以分離。各種不同的去垢劑與某些化學(xué)試劑聯(lián)用，在適當(dāng)?shù)臏囟认驴梢宰尩鞍讟悠酚羞x擇性地溶解或沉淀。readyprep 試劑盒所需的樣品量較少（zui多2ml），不需要額外的設(shè)備；因而是一種既節(jié)省時(shí)間，又節(jié)省投資的好方法。
readyprep 產(chǎn)品線包含一系列2-d 樣品制備試劑盒，不僅適用于通用樣品（總蛋白）處理，而且可以將復(fù)雜樣品按特定方法分級(jí)。處理通用樣品的試劑盒包括總蛋白抽提和蛋白凈化（clean-up）。樣品分級(jí)試劑盒可用來降低樣品復(fù)雜程度，同時(shí)有助于低豐度蛋白的富集和鑒定。這類試劑盒又分為兩種，一種是基于蛋白不同的亞細(xì)胞定位來分離，另一種是對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分級(jí)，從而適和于總蛋白質(zhì)組分析。下面的流程圖將幫您確定哪種試劑盒對(duì)您更適合。
