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菌種的原生質(zhì)體融合育種方法

要使發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的種類、產(chǎn)量和質(zhì)量有較大的改善，先必須選取性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。菌種選育包括根據(jù)菌種的自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及根據(jù)遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和方法利用誘變育種技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程技術(shù)而進(jìn)行的誘變育種、細(xì)胞工程育種、基因工程育種等。

原生質(zhì)體融合育種

細(xì)胞壁被酶解剝離，剩下的由原生質(zhì)膜包圍的原生質(zhì)部分稱為原生質(zhì)體。原生質(zhì)體融合是通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生全重組子的過程。原生質(zhì)體融合技術(shù)是繼轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等微生物基因重組方式之后，又個(gè)其重要的基因重組技術(shù)。原生質(zhì)體融合技術(shù)的運(yùn)用，使細(xì)胞間基因重組的頻率大大提高，基因重組親本的選擇范圍也得以擴(kuò)大，可以在不同種、屬、科，甚至更遠(yuǎn)緣的微生物之間進(jìn)行。這為利用基因重組技術(shù)培育更多更優(yōu)良的生產(chǎn)菌種提供了可能。原生質(zhì)體融合技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌的育種。

微生物原生質(zhì)體融合分為以下五大步驟：

1.選擇親株

為了能明確檢測到融合后產(chǎn)生的重組子并計(jì)算重組頻率，參與融合的親株般都需要帶有可以識(shí)別的遺傳標(biāo)記。常用營養(yǎng)缺陷型或抗藥性作為標(biāo)記，也可以采用熱致死、孢子顏色、菌落形態(tài)等作為標(biāo)記。在進(jìn)行原生質(zhì)體融合前，應(yīng)先測定菌株各遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性，如果自發(fā)回復(fù)突變的頻率過高，則不宜采用。

2.原生質(zhì)體制備

為了制備原生質(zhì)體，去除細(xì)胞壁是關(guān)鍵。去壁的方法有三種：機(jī)械法、非酶分離法和酶解法。般都采用酶解法去壁，根據(jù)微生物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)的不同，需分別采用不同的酶，如、纖維素酶、蝸牛酶等。

放線菌肽聚糖革蘭氏陰性菌肽聚糖和脂多糖和EDTA霉菌纖維素和幾丁質(zhì)纖維素酶或真菌中分離的溶壁酶酵母菌葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶

在菌體生長的培養(yǎng)基中添加，可以使菌體較容易被酶解，滲入細(xì)胞壁肽聚糖中代替D的位置，影響細(xì)胞壁中各組分間的交聯(lián)度。在菌體生長階段添加蔗糖，擾亂菌體的代謝，也能提高細(xì)胞壁對(duì)的敏感性。因?yàn)槟芨蓴_肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)肽作用，使多糖部分不能交聯(lián)，從而影響肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，所以，在菌體生長對(duì)數(shù)期加入適量，能使細(xì)胞對(duì)更敏感。

3.原生質(zhì)體融合

聚乙二醇（pEG）能有效地促進(jìn)原生質(zhì)體融合。其助融作用可能與下列過程有關(guān)：開始時(shí)，由于強(qiáng)烈的脫水而使原生質(zhì)體粘在起，并形成聚合體。原生質(zhì)體收縮并高度變形，使原生質(zhì)體之間的接觸面增大。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，加大了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，膜內(nèi)的蛋白質(zhì)和糖蛋白相互作用和混合，使緊密接觸的原生質(zhì)體相互融合。pEG對(duì)細(xì)胞尤其是原生質(zhì)體也有定的毒害作用，因此，作用的時(shí)間般不宜過長。pEG有不同的聚合度。在細(xì)菌原生質(zhì)體融合中，多采用高相對(duì)分子質(zhì)量的pEG（如pEG6000）；對(duì)放線菌則可采用各種相對(duì)分子質(zhì)量的pEG。pEG的使用濃度范圍般在30%~50%，但隨著微生物種類的不同而異。此外，物理融合劑，如電場和激光也能有效促進(jìn)融合。

4.融合體再生

融合體再生就是使原生質(zhì)體融合體重新長出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。能再生細(xì)胞壁的原生質(zhì)體只占總量的部分。細(xì)菌般再生率為3%~10%；真菌再生率般在20%~80%；鏈霉菌再生率高可達(dá)50%。若要獲得較高的再生率，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避免因強(qiáng)力動(dòng)作而使原生質(zhì)體破裂。在將原生質(zhì)體懸液涂布在再生培養(yǎng)基平板上前，宜預(yù)先去除培養(yǎng)基表面的冷凝水。涂布時(shí)，原生質(zhì)體懸液的濃度不宜過高。因?yàn)槿粲袣埓娴木w存在，它們將會(huì)在再生培養(yǎng)基中長成菌落，并抑制周圍原生質(zhì)體的再生。另外，菌齡、再生時(shí)的溫度、用量和溶壁時(shí)間等因素都會(huì)影響原生質(zhì)體融合體的再生。

5.篩選優(yōu)良性狀融合重組子

重組子的檢出方法有三種：直接法、間接法和鈍化選擇法。直接法是將融合液涂布在不補(bǔ)充親株生長需要的生長因子的高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子。間接法是把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上，檢出重組子。鈍化選擇法是在融合前使親本中的方（野生型）原生質(zhì)體代謝途徑中的某些酶鈍化不能再生，再與另方（雙缺陷型）原生質(zhì)體融合，融合體在基本培養(yǎng)基上分離。

以上獲得的還僅僅是融合重組子，尚需進(jìn)行生理生化測定及生產(chǎn)性能的測定，以確定是否符合育種的要求。