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菌種的基因工程育種方法

要使發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的種類、產(chǎn)量和質(zhì)量有較大的改善，先必須選取性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。菌種選育包括根據(jù)菌種的自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及根據(jù)遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和方法利用誘變育種技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程技術(shù)而進(jìn)行的誘變育種、細(xì)胞工程育種、基因工程育種等。

基因工程育種

20世紀(jì)70年代出現(xiàn)的基因工程技術(shù)給微生物育種帶來(lái)了革命性的變化?；蚬こ逃N是以分子遺傳學(xué)的理論為基礎(chǔ)，綜合分子生物學(xué)和微生物遺傳學(xué)的重要技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的門新興應(yīng)用科學(xué)，是種自覺的、能像工程樣事先設(shè)計(jì)和控制的育種技術(shù)，可以完成超遠(yuǎn)緣雜交，是新有前途的育種方法，所創(chuàng)造的新物種是自然演化中不可能發(fā)生的組合。因?yàn)榛蚬こ痰膶?shí)施先需要對(duì)生物的基因結(jié)構(gòu)、順序和功能有充足的認(rèn)識(shí)，而目前對(duì)基因的了解還十分有限，蛋白質(zhì)類以外的發(fā)酵產(chǎn)物（如糖類、有機(jī)酸、核苷酸及次代謝產(chǎn)物）的產(chǎn)生往往受到多個(gè)基因的控制，尤其是還有許多發(fā)酵產(chǎn)物的代謝途徑?jīng)]有被發(fā)現(xiàn)，所以就目前而言，基因工程的應(yīng)用仍存在著很大的局限性，基因工程產(chǎn)品主要是些較短的多肽和小分子蛋白質(zhì)。

基因工程育種的全部過(guò)程般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段與基因載體的體外連接、外源基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞和目標(biāo)基因的表達(dá)等主要環(huán)節(jié)。近年來(lái)出現(xiàn)的運(yùn)用基因工程定向育種的新技術(shù)主要有以下幾種。

1.基因的定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變（sitellspecific mutagenesis 或sitelldirected mutagenesis）是指在目的DNA片斷（如個(gè)基因）的位點(diǎn)引入特定的堿基對(duì)的技術(shù)，包括寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、盒式誘變以及以pCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變。pCR的定點(diǎn)突變技術(shù)由于具有突變效率高、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。因此，近十年來(lái)，定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展，并且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了很多新技術(shù)，如重疊延伸pCR法（overlap extension pCR，簡(jiǎn)稱EOlpCR）、大引物pCR法（megaprimer pCR）、步重疊延伸pCR（onelstep overlap extension pCR，簡(jiǎn)稱OOE圖pCR）、單管大引物pCR（singlelltube megaprimer pCR）、快速定點(diǎn)誘變法、多位點(diǎn)環(huán)狀誘變法和TAMS（targeted amplification of mutant strand）定點(diǎn)誘變技術(shù)。在這些技術(shù)中，單管大引物pCR和TAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)為簡(jiǎn)單和適用，并得到廣泛的應(yīng)用。

2.易錯(cuò)pCR DNA聚合酶在進(jìn)行擴(kuò)增目的DNA時(shí)會(huì)以定的頻率發(fā)生堿基錯(cuò)配，這現(xiàn)象恰好提供了種對(duì)特定基因進(jìn)行隨機(jī)誘變的可能方法。利用pCR過(guò)程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配進(jìn)行特定基因隨機(jī)誘變的技術(shù)就稱為易錯(cuò)pCR（errorlprone pCR，簡(jiǎn)稱Ep圖pCR）。

利用Mn2+替代天然的輔助因子Mg2+，使Taq DNA聚合酶缺乏校對(duì)活性，同時(shí)使反應(yīng)體系中各種dNTp的比例失衡，因此導(dǎo)致堿基的錯(cuò)配率大大增加，通常約為0.1%。另外，還可以在該反應(yīng)體系中加入dITp等三磷酸脫氧核苷類似物來(lái)控制錯(cuò)配水平。這種方法可以將錯(cuò)配率提高至20%。從易錯(cuò)pCR的操作過(guò)程可以看到，此法與傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)之間的差別就在于，前者是基因水平上的隨機(jī)突變操作，而后者則是細(xì)胞水平上的隨機(jī)誘變技術(shù)。此外，易錯(cuò)pCR般只產(chǎn)生點(diǎn)突變，因此其產(chǎn)生的突變體在多樣性方面尚有定缺陷。但作為種能夠從單基因產(chǎn)生豐富的隨機(jī)突變體的技術(shù)，易錯(cuò)pCR仍有廣泛的應(yīng)用域。

3.DAN重排

DNA重排（DNA shufling）技術(shù)是種利用重組文庫(kù)的體外定向進(jìn)化技術(shù)，是由Stemmer于1993年先提出的。DNA重排的基本原理是，先將同源基因（單基因的突變體或基因族）切成隨機(jī)大小的DAN片段，然后進(jìn)行pCR重聚，那些帶有同源性和核苷酸序列差異的隨機(jī)DAN片段在每輪循環(huán)中互為引物和模板，經(jīng)過(guò)多次pCR循環(huán)后能迅速產(chǎn)生大量的重組DNA，從而創(chuàng)造出新基因。

DNA重排的大特點(diǎn)是在反復(fù)突變過(guò)程中引進(jìn)了重組這自然進(jìn)化中重要的過(guò)程，而且其對(duì)可操作的靶序列的長(zhǎng)度沒有任何要求，可以達(dá)到幾萬(wàn)kb。通過(guò)多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，同時(shí)還打破了傳統(tǒng)物種之間由于生殖隔離導(dǎo)致不能重組的界限。由于可以產(chǎn)生豐富的重組突變體文庫(kù)，因此該技術(shù)已經(jīng)在許多域得到廣泛應(yīng)用，其中包括：改善生物分子的活性和穩(wěn)定性，在非天然環(huán)境下改善蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性，開發(fā)酶抑制劑，提高抗生素抗菌活性或開發(fā)抗生素新功能，擴(kuò)大酶作用的底物范圍及改變底物特異性，發(fā)現(xiàn)新型疫苗和藥物分子，提高抗體親和力，以及開發(fā)新的代謝途徑等。

4.基因組重排

基因組重排（genome shufling）技術(shù)是受DNA重排的啟發(fā)，于21世紀(jì)出現(xiàn)的全基因組改組技術(shù)。這種技術(shù)將分子定向進(jìn)化的對(duì)象從單個(gè)基因擴(kuò)展到整個(gè)基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對(duì)菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。先，利用經(jīng)典的誘變育種技術(shù)獲得含有目標(biāo)性狀的基因組庫(kù)，然后利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將這些發(fā)生正向突變的菌株的全基因組進(jìn)行多輪隨機(jī)重組，從而快速篩選出表型得到較大改進(jìn)的雜交菌種。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)（即將各種親本制成原生質(zhì)體-融合-再生，再制成原生質(zhì)體-融合-再生…），即遞歸原生質(zhì)體融合（recursive protoplast fusion）的方法。與DNA重排技術(shù)相比，該法的大特點(diǎn)是不必了解菌株的遺傳背景，在細(xì)胞水平上即可進(jìn)行定向進(jìn)化。在人們對(duì)微生物的遺傳特性尚未掌握的今天，利用基因組重排技術(shù)可快速實(shí)現(xiàn)基因的突變與篩選，其有可能成為現(xiàn)代工業(yè)微生物育種的種有效手段。