黃曲霉毒素B1（AFB1）酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒使用說明

方法編號：CDC-5511

本測試盒用間接競爭免疫分析法定量測定谷物中AFB₁。該測試盒反應孔可拆卸，可測單份樣品，也可測多份樣品。定量分析時需有含450nm波長的微孔板酶標儀。

1 概要

黃曲霉毒素是由曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產生的次級代謝產物，主要污染玉米、花生、堅果等。天然污染的黃曲霉毒素以AFB₁為主，AFB₁屬于強烈致癌物質，肝臟是其主要的靶器官，具有*的急性毒性和致癌性。

AFB₁檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）和ELISA方法，本試劑盒是以應用單克隆抗體為基礎的ELISA檢測方法，可以準確快速檢測糧谷類和花生及飼料中的AFB₁。

2 測定原理

本試劑盒采用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，利用間接競爭ELISA法進行測定。用抗原包被微孔板，加入AFB₁標準品或樣品、抗AFB₁單克隆抗體進行孵育后，將未與包被抗原結合的抗體洗去；再加入酶標記的抗鼠IgG抗體孵育，加入顯色液，經過終止液終止后，用酶標儀在450nm處測定OD值。

3 提供的物品

----微孔板…………………………………………………………… 包被有AFB₁-BSA

----5個濃度的AFB₁標準溶液（各0.5mL）

標準1：0ng/mL…………………………………………………………….直接使用

標準2：0.1ng/m…………………………………………………………….直接使用

標準3：0.2ng/mL ………………………………………………………….直接使用

標準4：0.5ng/m………………………………………………….…………直接使用

標準5：1.0ng/m………………………………………….…………………直接使用

----抗AF B₁單克隆抗體溶液（6mL）……………………………………………直接使用

----酶標物（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----顯色液（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----終止液（6mL）…………………………………………………………………直接使用

----濃縮洗液（30mL）..……………………………………………………………稀釋使用

4 盒中未提供，需自備物品

----微孔板酶標儀（可于450nm處測定）、振蕩器、粉碎機、微量移液器

----量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙

----氯化鈉（分析純）、甲醇（分析純）、去離子水或蒸餾水

5 操作者注意事項

       ----標準溶液中含有黃曲霉毒素，應特別小心。

----使用過的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液用pH7的次氯酸溶液（10%v/v）浸泡過夜。

----終止液含有硫（此處空白）酸，避免接觸皮膚。

----每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

----每步加樣時間應控制在5min內。

----孵育過程中應避光。

----不要使用過期試劑盒。

       ----不要交叉使用不同批號的試劑盒中的試劑。

6 儲存條件

       ----保存試劑盒于2~8℃。不要冷凍.

       ----顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

       ----將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2~8℃保存。

7 試劑變質的標志

       ----標準1的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。

8 樣品處理

----樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存。

----取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化鈉及25mL70%甲醇-水溶液。

----強力振蕩3分鐘。

----用快速定性濾紙過濾。

----取1mL濾液，加水4mL進行稀釋。

----取50μL稀釋液進行分析。

----*根據需要可以增減樣品量，但甲醇-水溶液的量也應相應增減。

9 酶免疫分析程序

----濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。

----取所需數(shù)量的板條插入微孔架，用洗液洗滌微孔板3min×2次。

----加入50mL標準品或處理好的樣品到微孔，記錄樣品及標準的位置，每個標準和樣品必須使用新的吸頭。

----加入50mL抗體溶液到每個微孔（注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入酶標物100mL，37℃孵育60min。

    ----用洗液洗滌微孔板3min×5次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入顯色液100mL（2滴），37℃孵育10~12min。

    ----每孔加入終止液50mL（1滴），立即用酶標儀在波長450nm處測定吸光度值（OD值）。

注：在定量分析中，顯色液和終止液需要用移液器準確量取。

10 樣品濃度計算

以標準溶液OD值與標準1OD值的比值為縱坐標，所對應標準溶液濃度（ng/mL）的對數(shù)值為橫坐標，制作標準曲線。根據樣品OD值與標準1OD的比值，可從曲線上得到對應點的橫坐標，即為AFB₁濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中AFB₁濃度C（ng/mL），按下列公式計算出樣品中AFB₁含量：

AFB₁含量（mg/kg）= C×K

式中：C：稀釋后樣品提取液中AFB₁含量（ng/mL）

            K：樣品稀釋倍數(shù)（按照本說明書中樣品處理程序方法為25）

11試劑盒主要技術指標及參數(shù)

測試盒zui低檢出濃度0.1ng/mL，回收率70%~120%，與AFB₂的交叉反應系數(shù)小于1%，與AFG₁的交叉反應系數(shù)為4.65%，與AFG₂交叉反應系數(shù)小于1%。試劑盒校正曲線的線性范圍0.1~1.0ng/mL，試劑盒條內變異＜10%，條間變異＜15%。

附圖（僅供參考）

                            AFB₁毒素濃度對數(shù)（ng/mL）