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促細(xì)胞分裂劑激活單核細(xì)胞
基本原理 :
本方法是通過促細(xì)胞分裂劑與細(xì)胞表面受體相互作用,在體外觸發(fā)細(xì)胞的多克隆激活。根據(jù)所使用的促細(xì)胞分裂劑的不同,應(yīng)答細(xì)胞可以是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞,或兩者同時(shí),或者是單核細(xì)胞。 細(xì)胞激活可以通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌、表面抗原表達(dá)和/或細(xì)胞體積的增加進(jìn)行檢測。例如在使用B細(xì)胞激活劑時(shí),可以通過多克隆免疫球蛋白的分泌進(jìn)行檢測。
表1 常用的促細(xì)胞分裂劑和多克隆淋巴細(xì)胞激活劑
促細(xì)胞分裂劑 | 所 用 濃 度 | 應(yīng) 答 細(xì) 胞 |
刀豆蛋白A ConA | 1- 10 μg/ml | T 淋巴細(xì)胞 |
植物凝集素PHA | 1-5 μg/ml | T 淋巴細(xì)胞 |
佛波醇酯PMA | 1-10 ng/ml | T 淋巴細(xì)胞 |
婁諾霉素+PMA | 100-500 ng/ml | T 淋巴細(xì)胞 |
脂多糖LPS | 2-25 μg/ml | 鼠B細(xì)胞(T不依賴型), 單核細(xì)胞 |
美洲商陸PWN | 試驗(yàn)測定 | 人B細(xì)胞(T依賴型) |
葡萄球菌A,SAC | 1/1000-1/10000 | 人B細(xì)胞 |
試劑和設(shè)備:
l 細(xì)胞懸浮液;
l 96孔平底組織培養(yǎng)板;
l 含血清培養(yǎng)基(通常為 RPMI 1640,含10% 胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素);
l 促細(xì)胞分裂劑(見表1),要求純品或半純品,有市售商品;
l 多通道移液器和微量移液器;
l 帶570nm濾片的酶標(biāo)儀;
l 超凈工作臺;
l CO2孵箱;
l 冷凍離心機(jī)。
操作步驟:
(一) 促細(xì)胞分裂劑制備
根據(jù)說明書將促細(xì)胞分裂劑重新溶解于水或培養(yǎng)液中,制成儲存液(如100´),保存于-20℃。
(二) 促細(xì)胞分裂劑滴定
1.在培養(yǎng)液中稀釋儲存液到所需的*個(gè)濃度,通常為理論*濃度的10倍;
2.在培養(yǎng)板或試管中直接將促細(xì)胞分裂劑進(jìn)行濃度遞減系列稀釋(100 μl/孔);
3.每孔平行重復(fù)三次;
(三) 細(xì)胞激活
1. 分離外周血單核細(xì)胞;
2. 室溫下用培養(yǎng)液300´ g離心10分鐘,收集并洗滌細(xì)胞;
3. 計(jì)數(shù)細(xì)胞并將細(xì)胞在培養(yǎng)液中重新懸浮至106細(xì)胞/ml,在培養(yǎng)板中每孔加入100μl;
4. 在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育(細(xì)胞增殖需2-3天;細(xì)胞因子測定測定6小時(shí)-2天;免疫球蛋白分泌測定需5-10天);
(四)細(xì)胞激活定量測定方法
1. 細(xì)胞增殖檢測方法采用MTT測定法;
2. 細(xì)胞因子分泌測定或使用市售商業(yè)化試劑盒;
3. 免疫球蛋白分泌測定采用ELISA檢測
對照試驗(yàn):
1. 陰性對照:不含促細(xì)胞分裂劑的培養(yǎng)液為對照組;
2. 促細(xì)胞分裂劑沒有陽性對照。通常利用滴定曲線進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)確定促細(xì)胞分裂劑的*濃度以及*培養(yǎng)時(shí)間。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明:
1. 促細(xì)胞分裂劑的計(jì)量應(yīng)答曲線通常為鐘形,并且高濃度的促細(xì)胞分裂劑其效果較差;
2. 盡量避免細(xì)胞濃度過低,不要采用圓底培養(yǎng)板;
3. 抗CD3和抗TCR抗體可以用于T淋巴細(xì)胞激活;
4. 偶聯(lián)到小珠上的抗免疫球蛋白抗體可以用于B淋巴細(xì)胞激活。
*節(jié) 細(xì)胞冷凍和復(fù)蘇
基本原理:
在長期的細(xì)胞培養(yǎng)過程中可能會出現(xiàn)微生物污染或基因型改變等情況,會導(dǎo)致具有優(yōu)良特性細(xì)胞系的丟失。為防止這些細(xì)胞的丟失,細(xì)胞可以經(jīng)快速冷凍并幾乎無限期保存在非常低的溫度下,如液氮(-176℃)。
試劑和設(shè)備:
l 冷凍液: 90%滅活血清+10%DMSO(或甘油),用0.45μm微孔濾膜過濾除菌,4℃保存;
l 培養(yǎng)液;
l 臺盼藍(lán)溶液(0.4%溶解于PBS);
l 70%乙醇;
l 組織培養(yǎng)瓶;
l 15-50 ml 無菌圓錐底離心試管;
l 離心機(jī);
l 血球計(jì)數(shù)板;
l 超凈工作臺;
l 光學(xué)顯微鏡;
l 37℃水??;
l 冷凍管;
l -80℃冰箱;
l 液氮和液氮容器。
操作步驟:
(一)冷凍細(xì)胞
1. 收集對數(shù)生長期細(xì)胞;
2. 以25μl臺盼藍(lán)溶液稀釋25μl細(xì)胞懸液;用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率(至少應(yīng)該在90%以上);
3. 細(xì)胞懸液在4℃ 條件下200´g離心10分鐘;
4. 將沉淀的細(xì)胞重新懸浮在冷凍液中(大約5´106細(xì)胞/0.5 ml 冷凍液);
5. 將細(xì)胞懸液加入到冷凍管中,每管0.5 ml;
6. 將冷凍管置于-80℃冰箱中;
7. 24小時(shí)后,將冷凍管移入液氮罐中;
8. 在記錄本或電腦中記錄下每一個(gè)冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時(shí)能夠找到每一個(gè)冷凍管。
(二)細(xì)胞復(fù)蘇
1. 將冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37℃水浴中,冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染,不定時(shí)攪拌加速解凍;
2. 當(dāng)細(xì)胞*解凍后,用含70%乙醇的紗布擦拭冷凍管消毒;
3. 將解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含4℃預(yù)平衡培養(yǎng)液的試管中;
4. 細(xì)胞懸液在4℃下200´g離心10分鐘;
5. 棄上清,將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)液中;
6. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶,CO2孵箱中培養(yǎng);
7. 是用倒置顯微鏡檢查細(xì)胞存活率以及細(xì)胞密度,如果細(xì)胞密度過高,用培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度。
對照試驗(yàn)
在冷凍細(xì)胞被移入到液氮罐中一段時(shí)間后,取出一管細(xì)胞復(fù)蘇并進(jìn)行培養(yǎng)以檢測存活率。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明:
1. 嚴(yán)格遵守液氮操作規(guī)則(即戴上合適的手套和護(hù)目鏡),液態(tài)氮對眼睛極為有害;
2. 對一瓶細(xì)胞培養(yǎng)液要盡可能多分裝幾個(gè)冷凍管;
3. 延長暴露在DMSO中的時(shí)間對細(xì)胞有害,因此冷凍和解凍操作要盡可能快;
4. 細(xì)胞可以暫時(shí)穩(wěn)定保存在-80 ℃達(dá)數(shù)月;
5. 每批次冷凍和復(fù)蘇的細(xì)胞的存活率可能會不相同,為避免這個(gè)問題,每次細(xì)胞凍存分兩批以上進(jìn)行;
6. DMSO可以防止在細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)冰結(jié)晶,凍存過程需要逐步降低溫度;
7. 如果復(fù)蘇后細(xì)胞難以恢復(fù)到良好狀態(tài),可以使用含10%鼠胚胎成纖維母細(xì)胞培養(yǎng)上清的培養(yǎng)液以促進(jìn)恢復(fù);
8. 也可以用含20%熱滅活胎牛血清和10%DMSO的培養(yǎng)液為冷凍液。
第二節(jié) 支持物培養(yǎng)法培養(yǎng)貼壁細(xì)胞
基本原理:
通過在支持物(如蓋玻片)上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞,可以應(yīng)用抗體檢測細(xì)胞表面抗原的表達(dá)或進(jìn)行酶細(xì)胞化學(xué)以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。該方法的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞貼壁牢固,能夠維持細(xì)胞生長時(shí)的狀態(tài)。
試劑和設(shè)備
l 細(xì)胞懸浮液;
l 6孔平底組織培養(yǎng)板,或φ60 mm培養(yǎng)皿;
l 18mm x 18mm 或20mm x 20mm浸于75%乙醇中的蓋玻片;
l 含血清培養(yǎng)基(通常為 RMPI 1640,含10% 小牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素);
l 超凈工作臺;
l CO2孵箱;
l 蓋片鑷;
操作步驟:
1. 用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出,用無菌絲綢布擦拭干凈,不要用紗布;
2. 將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板(每孔一片)或培養(yǎng)皿中(每個(gè)平皿可放置2-3片);
3. 在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí);
4. 將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中,使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中;
5. 將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天,當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí),將培養(yǎng)板取出,用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片,用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明
1. 本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng),而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng),懸浮細(xì)胞可使用滴片法;
2. 所使用的蓋玻片應(yīng)該為玻璃制造,并經(jīng)過鉻酸洗液處理;
3. 蓋玻片非常薄,易碎,取放蓋玻片時(shí)動作要輕;
4. 如果需要更多生長狀態(tài)一致的細(xì)胞,可以使用較大的培養(yǎng)皿,但不宜過大,以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率;
5. 如果細(xì)胞貼壁生長能力較差,可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。
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